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显微图像分析的误差

 
同其它任何仪器一样,图像分析系统在使用过程中由于仪器本身的原因,人为原因等因素会带来各种误差。特别是在测量吸光度参数时,由于摄像机的不线性,显微镜视杨光不均匀、电压不稳引起的视杨光线的变化、样本染色的不一致或不均匀等都会使及光度参数发生错误。只有了解这些误差的来源才能有效地防止各种误差的影响,使测量的结果更加可靠。
 
仪器误差
  仪器误差包括摄像机不线性带来的误差,摄像机的电子噪声,分割时的阈值设置误差,标定误差等等。
 
摄像机不线性带来的误差
  在用CCD摄像机将显微镜下的光图像转换为电信号图像的过程中,输入的光信号与输出的电信号之间不是一个线性的关系。当光线比较暗时,电荷偶合器不易冲上电,在其输出端产生的电流很小,因而在灰度的低端数字是很不准的。只有当光强度达到定强点后,输入的光信号和输出的电信号之间才是线性的关系。
  有些文章认为这条曲线应该校正为直线,其线性度要求达到0.99。本人认为从数学上很容易做到这种校正的结果,但是在实际的应用中光学衰减片和标准密度片在显微镜下进行标定或调整时,由于物镜的放大倍率使其标定或调整的重复性很差,不易得到真实地校正曲线。而且在整个灰度范围内都校正为线性的,其低亮度部分需要加的改正系数很大,势必带来很大的误差。我们建议使用曲线中满足线性度要求的线性段来测量,即可以符合对测量线性度的要求,又不需要作复杂的线性校正。
 
显微镜视场光不匀的误差
  显微镜照射到样本上的光线在整个视场内是否均匀,是显微定量分析的必要条件。如果视场本身不均匀,同一个细胞落在屏幕不同的位置上测量的结果不同,这就推动定量的意义。因此,国际分析细胞学会要求用同一个细胞在屏幕27个位置上测量的结果的变异系数要小于2%。
  新近出产的OLYNPUS平视 场显微镜下,视场的照射光基本上是均匀的。早期的显微镜视场特别不均匀,蹭和四周的亮度相差最大可达到30~40个灰度级。尽管通过各种校正可减少视场不均匀带来的误差,但是,显微镜本身误差很大,有限的校正是不可能完全支队这种影响的。所以作为定量分析使用的显微镜应该选择性能优良的显微镜。
  视场光线不均匀可利用图像分析软件提供的功能进行检测,例如MPIAS系统便提供了两种检测方式。一种是动态的检测功能,通过“动态灰度测量”定义的小矩形框测量屏幕上蹭种四周的灰度值,找出其间的差值。一种是“测背底”对冻结后的屏幕图像进行灰度测量。
  对视场光线不匀的影响一般图像分析系统都可以进行校正,操作时先采集一幅空视场的图像作为背底图像存储在系统中,之后采集细胞图像时,将这两幅图像进行相减运算,减去引起视场不匀部分的灰度。便可消除视场不匀带来的误差。另外,如果采用屏幕上每个点的入射光灰度值作为吸收光的参照值进行吸光度计算,而不是以屏幕上最亮的点作为参照值,也可以有效地消除视场光不匀的影响。
 
样本最大吸收光和照射光波不一致误差
 
灰度阈值设置误差
  细胞的测量最后都要通过阈值分割,将需要测量的细胞与背底灰度分离开来。阈值设置过大会引起测量的细胞面积变大,阈值设置过小会引起测量的细胞面积变小。在多幅图像测量过程中,忽大忽小的阈值会带来较大的误差。因此,灰度阈值不仅设置要准确,而且还要求一致。
 
分辨率和标定误差
  这里讨论的只是图像的空间分辨率的误差。数字图像是由点阵组成的,如果所测量的物体组成的点阵较小,其测量误差较大。例如,一个测量的细胞长度如果有100个像素点组成,其长度测量的精确度不会忧于1%;如果其长度只有10个像素点,其长度测量的精确度还会优于10%。一般要求测量物体在屏幕上最小要有一个平方厘米大小为宜。
  在测量过程中,图像分析系统一般都要在每个物镜下进行长度定标,得出各个物镜下像素点所代表的实际长度。定标过程也会引入误差,假定定标尺的实际长度是L,在屏幕上该长度由X个像素点组成,从而每个像素点所代表的实际长度为L/X。可以推断,定标结果的精确度不可能优于(1/X)*100%。例如在下10倍的物镜下定标尺的实际长度是500m,在屏幕上该长度由600个像素点组成,从而每个像素点所代表的实际长度为500/600=0.8333m/像素,而定标的精确度将小于1/500x100%=0.16%。标定过和带来的相对误差将随X的增大而减小。如果我们在屏幕上只是选择较小的一段标尺来定标,例如只选用250m的长度来一标,其定标的精确度将小于1/250x100%=0.40%。因此,为了减小定标过程带来的误差,在屏幕上应该尽可能选择满屏的定标尺寸来定标。另外,由于摄像机各显微镜在水平方向的垂直方向不可能做到完全一致,好的显微镜和摄像机这两个方向不会出现很大的误差,质量较差的显微镜和摄像机会出现百分之几的误差。因此,图像系统最好在水平和垂直方向上都进行定标,然后根据定标结果校正其误差。
 
边缘误差
  在显微图像测量过程中,有些细胞不可避免地会落在屏幕的边缘上。如果测量边缘的细胞会因为细胞不全带来边缘误差。为了减小这类误差,国外的有些图像分析仪设置了防护区(guard region)图5.2b所示。设置了保护区后,细胞在测量框内或框上的测量,测量框以外的不测量。当保护区的宽度等于或大于细胞的最大投影直径时,保护区的设置可以完全消除边缘误差。如果细胞的最大投影直径大于保护区的宽度,则保护区的设置不足以完全消除边缘误差。
  边缘误差可通过设置大于细胞最大投影直径的保护区宽度来消除。但是较大的保护区宽度会影响屏幕上有效地测量区域。
  采用上述保护区的方法能够有效地消除边缘误差,但是,在显微图像分析系统中我们往往还需要在测量细胞的同时,得出体视学上所需要的场参数。即图像框中所有细胞的面积之和与图像框的面积之比。
 
人为误差
  人为的误差是最不易发现的且随机出现的误差,这种误差有时会比测量的精确度高出数倍,使测量结果完全推动意义。如灰度阈值的人为不正确设置,人为的原因造成的定标错误或有时在采集图像时更换了物镜忘记了定标,测量中为了省事图快在较低倍率下测量。有些技术人员因为工作忙,在对组织切片中的肿瘤细胞进行手动测量时,不仔细地沿细胞边缘画线,而是粗糙地任意勾画等等。
 
  在测量的样本比较规则,例如测量鸡红细胞,虫卵等样本时,通过统计结果或直方图可明显地看出一些人为的误差。有些不可能出现的特别大和特别小的数据,往往是相连的细胞和没有完全删除的二值化后留下的噪声点。而在一些本来大小相差就比较悬殊的样本,人为测量错了的数据就不易被发现。在MPIAS系统中,通过浏览被测细胞通常可发现很多测错了的杂质和相连的细胞。
 
  在人为误差中,很大一部分误差是因为 工作不仔细造成的,工作人员只要本着对工作认真负责的态度是可以克服的。有些误差是要求工作人员了解一些统计学抽样的基本知识,通过严格的随机抽样是可以避免的。有关样本的抽样误差和图像视野的随机选择有关的书籍和文章已有详细讲解,这时里就不重复了。
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