西京骨科医院提醒你:
导师介绍
研究生教学
研究生风采
博士论坛
论文集锦
历届博士生
历届硕士生
在读博士生
在读硕士生
博士后
 
 
 
 
你的位置:首页 -> 研究生培养 -> 博士后

廉凯

作者:佚名  来源:本站整理  发布时间:{$WriteTime}

廉凯博士后

博士后研究工作报告题目:

一部分:人骨形态发生蛋白2重组腺病毒载体的构建及其在兔骨髓基质细胞中的表达

第二部分:重组腺病毒载体介导的人骨形态发生蛋白2基因转染对兔骨髓基质细胞成骨活性的影响

第三部分:组织工程化仿生人工骨修复兔桡骨节段性骨缺损

工作完成时间:2000年12月至2002年12月

中文摘要

严重创伤、感染、肿瘤切除等往往可以导致骨质缺损、骨折延迟愈合甚至不愈合,如何促进其修复一直是修复重建外科的一项重要课题。传统治疗以自体骨移植为最优,但是自体骨来源有限,并且会对供体造成新的缺损。异体骨有免疫原性,而且有潜在传染病原体的危险。人工骨移植替代材料则缺乏骨诱导能力。寻找新的骨修复治疗方法一直是近年来骨科领域竟相研究的热点。随着生命科学和材料科学的不断突破,采用基因治疗和组织工程学手段来促进骨修复为最终解决这一临床难题带来希望。
骨组织工程的三大要素是:种子细胞、生长因子和载体材料。在诸多参与骨生长调节的生长因子当中,骨形态发生蛋白的生物作用最为重要,也是目前唯一证实具有明确骨诱导作用的骨生长因子。骨髓基质细胞具有多向分化潜能,在多种化学药物和生长因子如BMP的诱导下可以向成骨细胞方向转化,并且具有增殖能力强、培养容易和来源充足等优点。多孔纳米晶羟基磷灰石-胶原/聚左旋乳酸(NHAC/PLLA)仿生基质材料是一种新型生物复合材料,具备良好的生物相容性、骨传导性和一定的生物可降解性。本研究针对以上三大要素,尝试通过基因转染手段对种子细胞进行基因化修饰,同时构建组织工程化人工骨以修复兔节段性骨缺损,从而为基因治疗和骨组织工程的有机结合奠定基础。具体研究内容包括以下三个部分:

第一部分:人骨形态发生蛋白2重组腺病毒载体的构建及其在兔骨髓基质细胞中的表达
重组腺病毒是近年应用最为广泛的基因治疗载体系统之一,具有对人的致病性小、宿主细胞广泛、繁殖滴度高、不整合等特点。因而应用腺病毒载体进行基因转染时,其转染细胞的目的基因表达是暂时性高水平表达,尤其适合于骨组织修复治疗。本研究的目的在于构建一种具有高转染效率的携带人骨形态发生蛋白2的重组腺病毒载体,并观察其在转染后的骨髓基质细胞中的表达情况,以期证实重组腺病毒作为人骨形态发生蛋白2基因治疗载体的可行性。大致的实验步骤如下:
1. 采用基因重组技术将hBMP2 cDNA定向克隆到PDC315穿梭质粒中,构建出重组穿梭质粒,并用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切对重组体进行鉴定;
2. 在脂质体的介导下,将hBMP2-PDC315穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,待出现典型CPE且50%的细胞从培养板脱落时,收集细胞并行-80℃、37℃反复冻融3次以使细胞充分裂解,病毒上清置-80℃保存;
3. 从病毒上清液中提取DNA,采用自行设计的针对hBMP基因的引物进行人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的PCR鉴定;
4. 采用终点稀释实验对扩增后的人骨形态发生蛋白2重组腺病毒进行滴度测定;
5. 将第三代骨髓基质细胞以1×105个/孔接种于预置盖玻片的六孔培养板中,24小时后换用MOI为100的Ad- hBMP-2病毒液,24和48小时后分别取出盖玻片,4%多聚甲醛4℃固定60分钟,行细胞原位杂交和免疫组化染色。
实验结果为:重组质粒hBMP2-PDC315双酶切后显示1.24Kb和3.9Kb二条带,符合物理图谱;腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre和穿梭质粒重组体hBMP2-PDC315共转染HEK293细胞后7-10天即可于倒置显微镜下观察到细胞病变反应;重组腺病毒DNA经PCR反应可以扩增出338bp目的片段;终点稀释实验测定的最终病毒滴度为1.38×108pfu/mL;100MOI的Ad- hBMP-2转染24小时后大多数兔骨髓基质细胞hBMP-2mRNA阳性表达,转染48小时后几乎所有兔骨髓基质细胞hBMP-2蛋白表达阳性。
本结果说明:构建的Ad- hBMP-2重组腺病毒转染具有高效性,可以作为进一步基因治疗研究的理想载体。


第二部分:重组腺病毒载体介导的人骨形态发生蛋白2基因转染对
兔骨髓基质细胞成骨活性的影响
骨形态发生蛋白(BMPs)是转化生长因子β超家族成员之一,在成骨先质细胞的迁移、间充质细胞的增殖以及向成骨细胞方向分化过程中发挥着重要促进作用,是目前唯一经证实具有明确诱导成骨能力的骨生长因子。本研究尝试在重组腺病毒载体的介导下将hBMP-2基因转染入兔骨髓基质细胞,并观察基因修饰的骨髓基质细胞成骨能力的改变,从而为进一步治疗研究奠定基础。主要实验方法如下:
1. 将第三代骨髓基质细胞以1×104个/孔接种于预置盖玻片的六孔培养板中,24小时后换用MOI为100的Ad- hBMP-2病毒液,常规培养7、14天后,取出盖玻片, 4%多聚甲醛4℃固定60分钟,行I型胶原原位杂交染色,并在Leica计算机图象分析系统下行细胞内杂交颗粒灰度值测定。
2. 将第三代骨髓基质细胞以1×103个/孔接种于96孔培养板中,同样方法转染,7、14天后行ALP活性测定和总蛋白含量测定,计算ALP比活性值。
3. 收集Ad-hBMP-2转染7天的兔骨髓基质细胞,通过透射电镜观察其超微结构的变化。
4. 收集Ad-hBMP-2转染48小时后的骨髓基质细胞5×107个/mL,无菌条件下注入裸鼠右后肢股部肌袋中,术后3、6周取材行HE染色。
结果证实:Ad-BMP-2转染7天和14天后,大多数骨髓基质细胞I型胶原mRNA表达呈阳性或强阳性,与对照组相比,表达强度有极显著性差异(P<0.01);Ad- hBMP-2转染可以明显提高骨髓基质细胞内ALP活性,与对照组相比,差异有极显著意义(P<0.01),并且实验组14天的ALP活性显著高于7天(P<0.05);Ad- hBMP-2转染组骨髓基质细胞粗面内质网扩张成囊状,内有中等电子密度的蛋白样分泌物;Ad- hBMP-2转染的兔骨髓基质细胞植入裸鼠肌袋3周后局部出现较多软骨细胞团,6周后演变为小梁骨。
本实验结果说明,以Ad- hBMP-2为载体转染骨髓基质细胞,不仅可以为骨组织修复提供内源性生长因子BMP-2,而且还能够提供大量的成骨样种子细胞。

第三部分:组织工程化仿生人工骨修复兔桡骨节段性骨缺损
本研究将兔自体骨髓基质细胞与多孔纳米晶羟基磷灰石-胶原/聚左旋乳酸(NHAC/PLLA)仿生基质材料复合培养,体外组装成生物活性人工骨,然后回植自体体内以最大限度重建缺损骨组织,从而寻求治疗节段性骨缺损的新途径。主要实验方法为:
1. 抽取成年家兔骨髓并分离、培养和诱导骨髓基质细胞;
2. 将第三代骨髓基质细胞按3×107个/ml浓度接种于多孔纳米晶羟基磷灰石-胶原/聚左旋乳酸(NHAC/PLLA)材料中, 7天后取出细胞/材料复合物,分别行扫描电镜观察和植入实验组兔桡骨骨缺损处;
3. 手术造成兔右桡骨干15mm骨缺损动物模型,随机分为实验组、对照组和空白组,实验组植入自体骨髓基质细胞/仿生材料复合体,对照组仅植入仿生材料,空白组不作任何处理。通过X线、骨密度、组织学以及计算机图象分析等手段观察各组在不同时相的骨缺损修复情况。
结果发现:骨髓基质细胞在NHAC/PLLA材料中生长良好,复合培养7天时细胞基本汇合成片,细胞表面和周围出现少量胶原纤维;实验组较快地启动了骨修复反应,缺损区新骨生成量和骨密度远高于同期对照组,术后24周基本完全修复骨缺损;对照组骨缺损未修复,仅于两侧近截骨端区域出现新生骨;空白组骨缺损则被纤维组织充填,截骨端硬化封闭。
本研究提示:采用组织工程学技术修复节段性骨缺损是一条切实有效的治疗手段,有较广泛的临床应用前景。

个人简历

 

1986.91991.7  湖北医科大学医疗系  本科生

1991.81995.8  湖北省襄樊市中心医院骨科 住院医生

1995.91997.8  同济医科大学协和医院骨科 硕士研究生

1997.92000.8  同济医科大学协和医院骨科 博士研究生

2000.122003.5 第四军医大学西京医院全军骨科研究所 博士后

 

 

永久通信地址

E-mail: liankai2000@163.com

 


 

版权所有:西京骨科医院
电话:029-84773524 传真:029-84773524 Email:gumishu@fmmu.edu.cn 
陕ICP备06008626号 地址:陕西省西安市长乐西路15号 邮编:710032 技术支持:奈特星网络公司